Actividad antimicrobiana de glicéridos de ácido butírico frente a Salmonella Typhimurium y Clostridium perfringens

1. Namkung 1 , H. Yu2 , J. Gong 2 , S. Leeson1
2. Departamento de Ciencia Animal y Avícola, Universidad de Guelph
3. Programa de Investigación Alimentaria, Agricultura y Agroalimentación de Canadá

Artículo publicado en: 2011 Poultry Science 90:2217–2222 doi:10.3382/ps.2011-01498.

Resumen

Se han estudiado las actividades antimicrobianas del ácido n-butírico y sus derivados contra la Salmonella Typhimurium y Clostridium perfringens. Se agregó ácido n-butírico y sus derivados (monobutirina y una mezcla de mono-, di- y tri glicéridos de ácido butírico) a diferentes concentraciones (entre 250 y 7.000 mg/kg a un medio inoculado con Salmonella Typhimurium o C. perfringens. La actividad antimicrobiana del ácido butírico contra C. perfringens se midió con dos concentraciones de la bacteria y dos inoculaciones en condiciones aeróbicas o anaeróbicas.

La actividad antimicrobiana más eficaz para la Salmonella Typhimurium se observó con el ácido n-butírico, con 90% de inhibición a una concentración de 1.500 mg/kg. Aunque se observó una inhibición mínima para Salmonella Typhimurium con glicéridos de ácido butírico, la adición de lipasa a una mezcla de mono-, di- y triglicéridos de ácido butírico aumentó (P<0,01) la actividad antimicrobiana de estos derivados.> <0,01) la actividad antimicrobiana de estos derivados.

La actividad antimicrobiana del ácido butírico y su derivado contra C. perfringens fue mayor cuando se utilizó una concentración inicial de inoculación moderada (105) en comparación con una concentración inicial más alta (107) de esta bacteria. Se observó una tasa de inhibición de >90% por todos los glicéridos de ácido butírico con inoculación aeróbica previa a 2.000 mg/kg con una inoculación inferior de C. perfringens (105), mientras que con la inoculación anaeróbica, sólo el 50% de monobutirina mantuvo un efecto inhibidor a 3.000 mg/kg. El efecto antimicrobiano de la monobutirina contra C. perfringens fue generalmente mayor (P<0,01) para la monobutirina al 50% que para la monobutirina al 100%. Tanto una mezcla de derivados del ácido butírico o la monobutirina al 50% disminuyeron  (P<0,01) C. perfringens en un medio con contenido intestinal mientras que sólo la monobutirina al 50% disminuyó (P<0,01) Salmonella Typhimurium en un medio con contenido cecal de Leghorns maduros. Estos resultados muestran que el ácido n-butírico y la monobutirina al 50% pueden controlar Salmonella Typhimurium o C. perfringens en especies de producción avícolas.

Introducción

Los ácidos orgánicos de cadena corta se han utilizado ampliamente como aditivos para raciones en aves de corral para el control de bacterias patógenas. La actividad antimicrobiana de los ácidos grasos de cadena corta contra las bacterias patógenas parece depender del tipo de ácido graso, la forma, el pH, el tiempo de exposición, el grado de sensibilidad de los tipos específicos de patógenos, y la cantidad utilizada (Goepfert y Hicks, 1969; Abdul y Lloyd, 1985; Fukushi et al., 2003). Se ha demostrado que los ácidos grasos y sus monoglicéridos son más eficaces para inhibir el crecimiento bacteriano (Kabara, 1979, 1984; Thormar et al., 2006) que los di- y triglicéridos de estos mismos ácidos grasos (Razavi-Rohani y Griffiths, 1994). Se ha propuesto que la actividad antimicrobiana de los ácidos orgánicos se atribuye a la capacidad de estos de pasar a través de la membrana celular y disociarse en la célula más alcalina, acidificando así el citoplasma celular (Kashket, 1987; Salsali et al., 2008).

El ácido butírico, un ácido graso de cadena corta que tiene 4 átomos de carbono, ha demostrado que reduce la colonización de Salmonella en ciego (Cox et al., 1994) y la invasión de bacterias de Salmonella en las células epiteliales del ciego de los pollos (Van Immerseel et al., 2004). Además, se ha informado que la suplementación de glicéridos de ácido butírico en las dietas de pollos de engorde aumentó su peso en la carcasa y carne de la pechuga (Leeson et al., 2005).

Los monoglicéridos de ácidos grasos de cadena corta tienen una actividad antimicrobiana comparable o mejor en comparación con los ácidos grasos libres (Bergsson et al., 2001; Sun et al., 2003; Hilmarsson et al., 2006). Los monoglicéridos de ácidos grasos tienen una ventaja en manipulación porque no tienen el olor fuerte asociado a los ácidos libres y sólo se liberan bajo la acción de la lipasa en el intestino delgado. El objetivo del presente estudio fue comparar los efectos inhibidores in vitro de los glicéridos de ácido butírico con los efectos del ácido n-butírico libre contra Salmonella Typhimurium o Clostridium perfringens.

Materiales y métodos

Cepas Bacterianas

Se utilizaron cepas individuales de Salmonella Typhimurium y C. perfringens aisladas de pollos en el presente estudio in vitro. Salmonella Typhimurium se cultivó aeróbicamente en caldo de soja tríptico o en agar (Oxoid, Nepean, Ontario, Canadá) a 37°C. Clostridium perfringens se cultivó en caldo de infusión cerebro-corazón libre de oxígeno o agar (BHI; Oxoid) a 37°C en una cámara anaeróbica con una atmósfera de 85% de N2, 10% de CO2 y 5% de H2. El caldo BHI libre de oxígeno para la inoculación anaeróbica se hizo por aspiración y lavado con una atmósfera de 85% de N2, 10% de CO2 y 5% de H2 repetidamente hasta que la presión de vacío alcanzó 25 psi y no se formaron burbujas de aire en el medio hervido.

Productos de ácido butírico

El ácido butírico se disolvió en etanol al 50% para hacer una solución madre. Los productos de ácido butírico utilizados en el presente experimento fueron el ácido n-butírico (C4), 50% mono-butírico, 100% monobutirina, y Baby C4 (una mezcla de 30% mono- , 50% di-, y 20% triglicéridos de C4), proporcionados por Silo S.P.A (Firenze, Italia). La concentración inhibitoria de estos productos de ácido butírico contra Salmonella Typhimurium y C. perfringens se midieron en concentraciones que iban de 250 a 7.000 mg/kg. Para medir la concentración inhibitoria de los ácidos butíricos contra Salmonella Typhimurium, las bacterias se inocularon en un caldo de soja tríptico suplementado con ácidos butíricos e incubadas con agitación durante 6 horas a 37°C en condiciones aeróbicas.

Concentraciones e inoculaciones bacterianas

La concentración inicial de Salmonella Typhimurium en el medio de cultivo fue de 105/mL. Para C. perfringens se utilizó caldo BHI. La concentración inicial de C. perfringens al comienzo de la incubación fue de 105 o 107/mL. La inoculación de C. perfringens en el medio se llevó a cabo en condiciones anaeróbicas o aeróbicas.

El medio inoculado con C. perfringens se incubó en condiciones anaeróbicas sin agitación durante 8 h a 37°C. El efecto de la adición de lipasa a Baby C4 contra el crecimiento bacteriano se midió añadiéndola a Baby C4 a una concentración final de 40 U. El efecto del glicerol sobre el crecimiento bacteriano se midió añadiéndolo al ácido n-butírico. La relación lineal entre la densidad óptica de 600 nm y se establecieron las unidades formadoras de colonias de bacterias. La relación lineal entre unidades formadoras de colonias por mililitro y la densidad óptica de 600 nm fue Y = -8,625 × 1,606 (R2 = 0,96) para C. perfringens e Y = -2,635 × 1,043 (R2 = 0,98) para Salmonella Typhimurium. La concentración de la inoculación inicial de las bacterias se ajustó de acuerdo con estas ecuaciones. Tras la incubación, la turbidez del medio de cultivo incubado se midió utilizando la espectrofotometría a 600 nm para comparar la tasa de inhibición del crecimiento bacteriano de los glicéridos de ácido butírico. La tasa de inhibición de ambas especies de bacterias se midió en al menos 3 ensayos. Cada ensayo incluía 2 o 3 réplicas para cada concentración de productos de ácido butírico.

Ensayos In Vitro

El pH del medio suplementado con ácidos butíricos excepto en el caso de Baby C4 que contiene lipasa, se midió antes de la incubación, mientras que el pH del medio que contenía Baby C4 complementado con lipasa se midió después de la incubación en las mismas condiciones utilizadas para medir la turbidez de las bacterias. Para simular el contenido intestinal en estos productos de ácido butírico, el efecto inhibidor de los ácidos butíricos se midió también con contenidos cecales o intestinales sin procesar añadidos a los medios de cultivo.

El contenido cecal e intestinal se recogió aséptico de gallinas ponedoras sanas alimentadas sin antibióticos ni otros aditivos. Se utilizó el contenido cecal para medir el efecto sobre Salmonella Typhimurium y el contenido intestinal para C. perfringens. Los medios que con 25% de contenido cecal o 10% de contenido intestinal se inocularon con Salmonella Typhimurium a una concentración de 105 y C. perfringens a una concentración de 5 × 103, respectivamente. La Salmonella Typhimurium fue incubada en condiciones aeróbicas con agitación durante 6 h a 37°C, mientras que C. perfringens se incubó en condiciones anaeróbicas sin agitación durante 6 h a 37°C. La muestra incubada se diluyó en serie en la solución de peptona al 0,1% y Tween 80 al 0,1% y se homogeneizó. Para el recuento de las colonias de bacterias, las muestras diluidas se colocaron en agar azufre verde azul (Oxoid) suplementado con 50 µg/mL de ácido nalidíxico para Salmonella Typhimurium y agar perfringens (OPSP) con suplemento A y B (Oxoid) superpuesto con OPSP adicional en la superficie para C. perfringens. El agar azufre verde azul se incubó durante 24 horas a 37°C en condiciones aeróbicas y el agar OPSP se incubó anaeróbicamente durante 24 a 36 h a 37°C. Los datos de inhibición de los ensayos se combinaron para el análisis estadístico y se analizaron mediante un ANOVA de 1 vía utilizando el procedimiento GLM de SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Las diferencias entre las medias de los tratamientos se evaluaron utilizando la prueba de rangos múltiples de Duncan según SAS.

Resultados y discusiones

Las tasas de inhibición del ácido butírico y de varios glicéridos del ácido butírico contra Salmonella Typhimurium se muestran en la Tabla 1. En general, la tasa de inhibición del crecimiento por los ácidos butíricos aumentó con el incremento de la concentración de ácido butírico. El producto más eficaz fue el ácido n-butírico seguido de Baby C4 + lipasa, Baby C4, monobutirina al 100%, y el 50% de monobutirina, respectivamente (Tabla 1; P<0.01). Se observó una inhibición del crecimiento de la Salmonella Typhimurium de más del 90%, mientras que las monobutirinas y Baby C4 no mostraron una tasa de inhibición del 90% a las concentraciones utilizadas en el presente estudio. Aunque adición de lipasa al cultivo que contenía Baby C4 aumentó (P><0,01) el efecto inhibidor de Baby C4, la tasa de inhibición del 90% sólo se observó a 4.000 mg/kg en comparación con 1.500 mg/kg para el ácido n-butírico. El mayor efecto antimicrobiano del ácido n-butírico y el efecto inhibidor de Baby C4 por la adición de lipasa parecen estar asociados con el pH del medio de cultivo. El pH de los medios de cultivo se redujo gradualmente a medida que aumentaban las concentraciones de ácido n-butírico y de Baby C4 con lipasa.> . Se observó una inhibición del crecimiento de la Salmonella Typhimurium de más del 90%, mientras que las monobutirinas y Baby C4 no mostraron una tasa de inhibición del 90% a las concentraciones utilizadas en el presente estudio. Aunque adición de lipasa al cultivo que contenía Baby C4 aumentó (P<0,01) el efecto inhibidor de Baby C4, la tasa de inhibición del 90% sólo se observó a 4.000 mg/kg en comparación con 1.500 mg/kg para el ácido n-butírico. El mayor efecto antimicrobiano del ácido n-butírico y el efecto inhibidor de Baby C4 por la adición de lipasa parecen estar asociados con el pH del medio de cultivo. El pH de los medios de cultivo se redujo gradualmente a medida que aumentaban las concentraciones de ácido n-butírico y de Baby C4 con lipasa.

La lipasa se añadió a los medios de cultivo que contenían Baby C4 con la esperanza de romper los enlaces de esta fuente de ácido butírico por la lipasa, ya que el Baby C4 en este estudio es una mezcla de mono-, di- y triglicéridos de ácido butírico. El pH reducido de este medio de cultivo significa que la lipasa trabajó eficazmente para romper los enlaces de esta fuente de ácido butírico. La adición de glicerol al ácido n-butírico no cambió la tasa de inhibición del crecimiento del ácido n-butírico. Con los glicéridos de ácido butírico, las tasas de inhibición tienden a aumentar en general a medida que se incrementa la concentración, aunque no se observó ningún cambio en el pH del cultivo.

Los efectos inhibitorios del ácido butírico y los glicéridos contra C. perfringens se muestran en las tablas 2, 3 y 4. El efecto de inhibición del ácido butírico contra C. perfringens se midió con dos concentraciones iniciales de bacterias utilizando 2 inoculaciones de bacterias, a saber, en condiciones anaeróbicas o aeróbica.

Cuando las bacterias se inocularon de forma aeróbica (Tablas 2 y 3), el efecto inhibidor del crecimiento bacteriano de los ácidos butíricos tendió a verse afectado por la concentración inicial de bacterias. Se observó una mayor inhibición del crecimiento del ácido butírico frente a C. perfringens a una menor concentración inicial de bacterias de 105/mL en comparación con 107/mL (Tabla 3 comparada con la Tabla 2). A una concentración inicial de 107/mL (Tabla 2), tanto la monobutirina al 50% como el ácido n-butírico mostraron una mayor inhibición (P<0,01) que los demás productos de ácido butírico con una tasa de inhibición del 90% observada a 3.000 mg/kg (Tabla 2). Sin embargo, a una concentración inicial de 105/mL, se observó una tasa de inhibición del 90% para todos los productos de ácido butírico a unos 2.000 mg/kg.

El mayor efecto inhibidor (P<0,01) se observó con el 50% de monobutirina a la menor concentración utilizada. La adición de lipasa al medio que contenía Baby C4 redujo (P<0,01) las propiedades antibacterianas de este producto. Las tablas 3 y 4 muestran el efecto de utilizar condiciones de inoculación aeróbica o anaeróbica de C. perfringens en la tasa de inhibición de los productos con ácido butírico. El efecto inhibidor del ácido butírico y los glicéridos contra C. perfringens se redujo cuando las bacterias se inocularon en condiciones anaeróbicas. El mayor efecto inhibidor de los productos con ácido butírico en condiciones de inoculación aeróbica parece estar asociado con la exposición de bacterias anaerobias a la condición aeróbica. Utilizando la inoculación de bacterias anaerobias, sólo el ácido butírico y la monobutirina al 50% mostraron un 90% de inhibición a una concentración de 3.000 mg/kg (Tabla 4). Fue poco el efecto de la adición de lipasa a Baby C4 sobre la inhibición del crecimiento de C. perfringens.

El pH del medio de cultivo suplementado con ácido n-butírico y Baby C4 junto con la lipasa se redujo a medida que sus concentraciones en los medios de cultivo aumentaron (Tablas 5 y 6). Aunque la reducción del pH con Baby C4 más lipasa en los medios para C. perfringens fue tan alta como en los medios para Salmonella Typhimurium, la tasa de inhibición del crecimiento por Baby C4 más lipasa contra C. perfringens no fue tan alta como para Salmonella Typhimurium. Parece que C. perfringens es menos sensible al pH en comparación con Salmonella Typhimurium. Sun et al. (1998), informaron que la actividad antimicrobiana del ácido n-butírico parece verse afectada por el pH del medio y la concentración de ácido butírico. Utilizando varios glicéridos del ácido butírico tanto para Salmonella Typhimurium y C. perfringens, las tasas de inhibición del crecimiento aumentaban a medida que se incrementaban las concentraciones suplementarias, aunque esto no parece ser un factor del pH promedio. Sun et al. (2003), evaluaron el efecto de la potencia bactericida del ácido láurico y de la monolaurina. En su estudio, el pH para una óptima potencia bactericida del ácido láurico contra el Helicobacter pylori era de 4,5 a 5,0, mientras que la potencia bactericida de su monoglicérido, la monolaurina, se mantuvo en un pH de 4 a 10.

El efecto supresor de los productos de ácido butírico fue más intenso contra C. perfringens en comparación con Salmonella Typhimurium. El Baby C4 redujo (P<0,01) el crecimiento de C. perfringens un promedio de 1,9 log10 ufc/mL, mientras que la monobutirina al 50% redujo (P<0,01) la actividad en 5,5 log10 ufc/mL, con poco efecto de la concentración utilizada. Como se muestra en las Tablas 7 y 8, la suplementación de pequeñas cantidades de contenido intestinal al medio de cultivo inhibió significativamente (P<0,01) el crecimiento de ambas bacterias en comparación con el de los medios solos. Las respuestas de susceptibilidad de las bacterias medidas in vitro sin contenido intestinal en los medios fueron diferentes de las de los medios con contenido intestinal. Este resultado demuestra que el contenido intestinal en sí mismo tiene un efecto antimicrobiano. En un estudio in vitro sin contenido intestinal, la monobutirina al 50% tiene poco efecto inhibidor contra la Salmonella Typhimurium en comparación con el Baby C4. Sin embargo, se observó lo contrario cuando los medios tenían contenido intestinal. Teniendo en cuenta el mayor efecto inhibidor del 50% de monobutirina para Salmonella Typhimurium y C. perfringens en el cultivo con contenido intestinal, el 50% de monobutirina podría ser más ventajoso que el Baby C4, una mezcla de mono, di y triglicéridos de ácido butírico, para su uso práctico en la granja. El ácido butírico puro, aunque es muy eficaz, tiene limitaciones obvias de olor y manejo, y es prácticamente 100% absorbido en el tracto digestivo superior (Bolton y Dewar, 1965). Los glicéridos del ácido butírico ofrecen un novedoso sistema de administración al intestino delgado y proporcionan un potencial para el control de los patógenos intestinales. El monoglicérido del ácido butírico tiene la ventaja añadida de ser soluble en agua y, por lo tanto, tiene aplicación en la granja para controlar patógenos de varias edades de aves meta.

La inhibición de C. perfringens requirió mayores concentraciones de ácido n-butírico en comparación con Salmonella Typhimurium, con un 90% de inhibición del crecimiento de Salmonella Typhimurium con sólo 1.500 ppm mientras que, para C. perfringens, se necesitaron 3.000 mg/kg utilizando la inoculación anaeróbica. Skarivanova et al. (2006), informaron de las diferencias en la actividad antimicrobiana de los ácidos orgánicos entre especies de bacterias. Las actividades antimicrobianas de los derivados del ácido butírico fueron menores que las del ácido n-butírico. La monobutirina al 50% tuvo mayor actividad antimicrobiana para C. perfringens que para la Salmonella Typhimurium. La actividad antimicrobiana de Baby C4, una mezcla de mono-, di- y triglicéridos del ácido butírico, fue mayor con Salmonella Typhimurium que con C. perfringens inoculado anaeróbicamente. Estos resultados están probablemente relacionados con la diferencia en la capacidad de estos derivados para penetrar en la pared celular de las bacterias. Bergsson et al. (2001) midieron la actividad antimicrobiana contra el Staphylococcus aureus, mostrando que la monocaprina penetraba en la extensa malla de peptidoglicano de la pared celular y desintegraba la membrana celular. Razavi-Rohani y Griffiths (1994), informaron que la monolaurina era más eficaz para inhibir el crecimiento de las bacterias que los di- o triglicéridos de laurina. La monobutirina al 50% que contenía 50% de glicerol mostró una mayor actividad antimicrobiana (P<0,01) para C. perfringens en comparación con la monobutirina al 100%. Los efectos de la suplementación de ácido butírico y glicéridos sobre las bacterias inoculadas en un medio con contenido intestinal se muestran en las tablas 7 y 8. No hubo ningún efecto inhibidor de la suplementación de Baby C4 a la Salmonella Typhimurium inoculada en el medio con contenido cecal. Sin embargo, el 50% de monobutirina restringió significativamente (P<0,01) el crecimiento de Salmonella Typhimurium, aunque la reducción del crecimiento promedio fue inferior a 1,0 log10 ufc/mL (Tabla 7).

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