Arabinofuranosidasas: La revolución para potenciar la eficacia de las xilanasas

Las arabinofuranosidasas surgieron como la revolución en la eficacia de las xilanasas para descomponer la hemicelulosa en las plantas. Permiten aumentar la digestibilidad total del alimento desde la energía hasta la proteína. Para mejorar la expresión de esas enzimas objetivo, se desarrolló un nuevo método.

Estos costos están directamente relacionados con los propios mediadores de alostasis y no a la carga alostática per se, por lo que se denomina “desgaste” al costo de mantener y usar los sistemas fisiológicos que median la alostasis (Romero et al., 2009). Los carbohidratos representan la principal fuente de energía en los alimentos para animales; estos son encontrados esencialmente en cereales o subproductos de cereales. Sin embargo, además del almidón, el principal carbohidrato rico en energía; los cereales contienen polisacáridos no almidonosos (PNA), que no se digieren fácilmente en el intestino delgado de las aves y de los cerdos debido a la ausencia de las actividades enzimáticas necesarias y, por lo tanto, interfieren con la digestibilidad del alimento y la fisiología intestinal.

Los arabinoxilanos, principales PNA en cereales

PNA son β(α) polímeros, presentes principalmente en las paredes celulares del endosperma, pero también en el salvado. Ellos incluyen celulosa, hemicelulosas y pectina, y también se pueden dividir según su valor nutricional en fracciones solubles o insolubles en agua (Bach Knudsen, 2014). Se sabe que los PNA solubles poseen propiedades antinutricionales que encapsulan nutrientes y/o reducen la digestibilidad global de los mismos, mediante modificaciones dentro del tracto gastrointestinal.

Entre los cereales destinados a la nutrición animal, el maíz y el trigo son los más utilizados. Las paredes celulares de los tejidos externos del grano contienen principalmente celulosa y xilanos complejos, junto con una cantidad significativa de lignina. Por el contrario, en el endosperma, las paredes celulares contienen casi exclusivamente arabinoxilanos (AX) y b-glucanos. El arabinoxilano (AX) está compuesto por un esqueleto de xilosa unido por enlaces β-(1,4) que lleva residuos de arabinosa en las posiciones C(O)2 y/o C(O)3 de los residuos de xilosa. Los residuos de arabinosa podrían incluso ser sustituidos por ácido ferúlico o cadenas laterales más complejas que incluyen arabinofuranosa (feruloilada), xilosa, galactosa y ácido α-glucurónico.

La relación arabinosa:xilosa y el contenido de xilosa no-, mono y di-sustituida son variables entre los granos de cereales y también entre los diferentes tejidos dentro del mismo grano. Los heteroxilanos del maíz son más sustituidos que los del trigo y contienen más ácido glucurónico (8,3% frente a 2,6% de materia seca). El AX soluble más sustituido se encuentra en el arroz con una proporción de arabinosa: xilosa de 2,8 a 5,6. Esta complejidad afectará la susceptibilidad de las enzimas exógenas. Incluso si un alto grado de sustitución evita cualquier problema de viscosidad, la descomposición de tales estructuras mejorará la digestibilidad del alimento.

Tabla 1: Composición de PNAs (% relativa a Materia Seca) de algunos cereales (grano). Knudsen, 2014.

Cuando comparamos diferentes cereales, hay que considerar que, aunque el trigo tenga más PNAs totales, la ramificación de arabinoxilanos en el maíz es 20% mayor como está demostrado en la tabla 1 como la relación A/X (arabinosa/xilosa). Lo que nos trae el enfoque a enzimas desramificadoras.

Xilanasas y arabinofuranosidasas, diversidad y complementariedad para mayor eficiencia

Los polisacáridos pueden ser degradados por enzimas hidrolíticas que son parte de un grupo más grande llamado enzimas activas de carbohidratos (CAZymes – www.cazy.org). Se han clasificado en 5 grupos: glucósido hidrolasas (GH), glucosiltransferasas (GT), polisacáridos liasas (PL), carbohidratos esterasas (CE) y finalmente actividades auxiliares (AA), según sus dominios funcionales y módulos catalíticos. Están involucrados en la degradación de los diferentes polímeros presentes en la pared celular vegetal.

El grupo GH se subdivide en 133 familias, según la similitud de la secuencia de aminoácidos de las enzimas. La afinidad por las conformaciones de sustrato específicas puede variar de un grupo a otro, como en las xilanasas de las familias GH 10 o GH 11.

Al considerar la endo-1,4-b-xilanasa, este término cubre una variedad de proteínas con diferentes tamaños moleculares y distintas especificidades hacia sustratos similares al xilano. De hecho, las diversas endoxilanasas identificadas en Talaromyces versatilis difieren en su tamaño molecular, su pH óptimo y su selectividad o afinidad por sustratos insolubles o solubles. Entre las ocho diferentes endoxilanasas de Talaromyces versatilis se puede destacar que la XynD pertenece a la GH 10, mientras que XynB y XynC pertenecen a las familias GH 11.

Debido a su estrecha especificidad hacia un enlace, se requieren diferentes enzimas para la degradación de los arabinoxilanos. Aunque las endoxilanasas hidrolizan el esqueleto de xilosa, su actividad se ve frecuentemente obstaculizada por la sustitución con residuos de arabinosa. De hecho, para ser eficientes, la mayoría de las endo-1,4-b-xilanasas necesitan un tramo suficientemente largo de xilosas no sustituidas en la estructura del xilano (Lafond et al., 2014).

Las a-L arabinofuranosidasas (ABF) son glicosil hidrolasas capaces de retirar la arabinosa del esqueleto. Por tanto, son un actor importante del sistema hidrolítico para degradar hemicelulosas como arabinoxilanos, arabinananos y arabinogalactanos siendo esenciales en dietas ricas en maíz – escenario común en Latinoamérica.

Figura 1: Se requiere una gama de ABF para descomponer
todos los tipos de sustitución de xilosa (Abf 1 y 2 – GH 62;
Abf 3 y 4 – GH 54).

Las ABFs pertenecen a diferentes familias GH GH43, 51, 54, 62, … y son capaces de liberar arabinosa a partir de xilosas mono o di-sustituidas en oligo o polisacáridos (Figura 1, De La Mare et al., 2015).

Además, la principal característica de ABF es tener un pH óptimo más bajo que las endoxilanasas.

La consecuencia directa en el tracto digestivo es que la acción desramificante ocurre en la parte superior (estómago) mientras que las endoxilanasas actuarán más abajo a lo largo del tracto digestivo.

Arabinofuranosidasas: la revolución en la eficacia de las xilanasas

Para mejorar la eficacia del complejo enzimático originado por Talaromyces versatilis, recientemente se ha desarrollado un enfoque original en el área de biotecnología molecular (Guais et al., 2015). La base del método no era expresar una enzima degradadora de arabinoxilano en particular, sino más bien sobre expresar un factor de transcripción (XlnR) que permite estimular una serie de genes de GH dando como resultado una expresión mejorada de varias xilanasas nuevas, así como nuevas arabinofuranosidasas.

La Figura 2 muestra el efecto potenciador de ABF para eliminar las sustituciones y degradar los arabinoxilanos medidos por el método viscosimétrico. De hecho, cualquiera que sea la xilanasa simple obtenida de Talaromyces versatilis (Xyn B, C o D), la complementación con un solo ABF (Abf 51a) ya mejora la actividad de la xilanasa.

Figura 2: Efecto complementario de arabinofuranosidasa
(Abf – GH 51) y endoxilanasas (Xyn B, C y D de Talaromyces
versatilis
) medido por el método viscosimétrico.

La adición de múltiples arabinofuranosidasas a una xilanasa mejora la degradación de las partículas de arabinoxilano insolubles, como se puede demostrar en la Figura 3, gracias a un reactor de torio y una cámara CCD. Los mejores resultados se obtienen través de una combinación de arabinofuranosidasas con la xilanasa D (Figura 3).

Figura 3: Efecto de la xilanasa sola o combinada con diferentes ABF para degradar el arabinoxilano medido por la reducción del tamaño de partícula (Abf 1 – GH54; Abf 2 – GH62).

Lo más interesante es poder comprobar la sinergia entre las diferentes carbohidrasas y arabinofuranosidasas (ABFs) de un complejo multienzimatico (CME) también en experimentos in vivo.

Saleh et al (2019) demostraron los efectos en parámetros zootécnicos de pollos de 35 días alimentados con dietas basadas en maíz y soya suplementadas con CME que posé enzimas desramificadoras.

Las dietas del grupo Control Negativo (CN) tuvieron una reducción de 90kcal/kg de Energía Metabolizable Aparente (EMA) y un promedio de 3% de aminoácidos digestibles (AAd). Al analizar la conversión alimenticia (CA) se comprobó que la reducción de nutrientes afectó negativamente el desempeño de los animales, al paso que, cuando se suplementó el CME a esta dieta CN, se observó una mejoría en la CA, confirmando la liberación de nutrientes por el CME (Tabla 2).

Tabla 2: Efecto de la suplementación con CME sobre parámetros
zootécnicos de pollos de engorde a los 35 días (Saleh et al 2019).

El mismo efecto fue publicado por Cozannet et al., (2017) quienes demostraron que una combinación dietética de carbohidrasas y arabinofuranosidasas tuvo un resultado positivo en la utilización de energía y en la digestibilidad de proteína, grasa y fibras insolubles y solubles por pollos de engorde.

Además de efectos directos mejorando la digestibilidad de ingredientes vegetales, cuando se utiliza una asociación de enzimas carbohidrasas con enzimas desramificadoras, puede tenerse beneficios también en la salud intestinal, como ha publicado Lei et al. (2016) que utilizaron de una combinación de xilanasa, ABF y feruloil esterasa (otro tipo de enzima desramificadora).

Saleh et al. (2019) en la misma prueba también han demostrado que la combinación sinérgica de carbohidrasas y ABFs aumentó los parámetros sanguíneos relacionados con la inmunidad de los pollos (es decir, proteínas totales, globulina y títulos de anticuerpos séricos contra la ND y la influenza aviar H9N1).

Conclusión

La gran variedad de materias primas vegetales utilizadas en la nutrición avícola y porcina y la complejidad de los polisacáridos de cada una, muestran la necesidad de una amplia gama de actividades enzimáticas para aliviar la mayoría de sus efectos antinutricionales y obtener la plena disponibilidad de sus nutrientes.

La utilización de xilanasas únicas, o también en combinación con B-glucanasas o mananasas con el objetivo de liberar nutrientes claramente no es eficaz en dietas basadas en maíz/soya debido a la composición de estos ingredientes específicos.

La composición de PNAs del maíz es bien conocida y, por este cereal tener una gran sustitución de sus arabinoxilanos y, requiere enzimas complementares a las xilanasas para que estas tengan acceso completo al esqueleto de xilosa.

De esta manera, además de un amplio espectro de diferentes xilanasas que actúan a lo largo del tracto digestivo, en diferentes pHs; se requiere una gama de enzimas desramificadoras, como las arabinofuranosidasas (ABFs) para aumentar de manera eficaz y eficiente la liberación de nutrientes en dietas maíz/soya, muy comunes en América Latina.

Diversos autores comprobaron en experimentos in vivo que un complejo multienzimático que contenga ABFs en conjunto con diferentes carbohidasas pude traer beneficios expresivos a los animales, relacionados a no solamente aumento de digestibilidad de nutrientes, sino también una mejoría en la salud intestinal, siendo una excelente alternativa cuando se necesita mejorar el valor nutricional de una dieta, objetivando mejora desempeño animal y también la reducción en costos de formulación.

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