Caracterización molecular de la fibra del Adenovirus aviar GRUPO I

Elizabeth Sianquez¹ , Sandra Palma¹ , Julio Levano¹ , Alfredo Mendoza¹ ,
Melanie Caballero^1
1 Laboratorio de Investigación y Desarrollo, Quimtia S.A. Perú Proyecto
Cofinanciado con Contrato N°033-2019-FONDECYT-BM-INC.INV.

Objetivo

El objetivo del estudio fue caracterizar la presencia del gen de la fibra de los serotipos de FAdV-4, 8b y 11 mediante la optimización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple (PCRm).

Materiales y métodos

Extracción de ADN.

Se extrajo el ADN de 20 aislamientos de Hepatitis por Cuerpos de Inclusión, recolectados de diferentes granjas avícolas peruanas entre los años 1998 al 2021. Para la optimización de la PCRm se utilizaron tres muestras previamente identificadas como FAdV-4, 8b y 11.

Diseño de cebadores específicos.
Se seleccionaron secuencias idénticas de la fibra para cada serotipo en el Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), para luego ser alineadas mediante el programa Clustal Omega (v. 2.0.12). Se seleccionaron regiones conservadas entre el mismo serotipo, pero que a su vez no presenten identidad con las secuencias de los otros serotipos evaluados.

En base a estas secuencias se diseñaron los cebadores (sentido y antisentido) y se sintetizaron en un laboratorio externo (Integrated DNA Laboratory, EEUU).

Optimización de la PCRm.
Se sometieron los tres juegos de cebadores y los tres ADN identificados en una sola reacción. Se trabajaron con distintas condiciones, determinándose optimizada la PCRm al emplear 0.94X de concentración final de PCR Master Mix 2x (Promega corporation, EEUU), 5.18 mM de concentración final del ión magnesio (Mg2+), 0.37 μM de concentración final de cada cebador y, 7.54 a 15.09 ng/ μL de concentración final de cada ADN. El termociclador fue programado con una desnaturalización inicial de 3 min a 95°C; 20 ciclos de desnaturalización de 1 min a 95°C, alineamiento de 1 min a 54°C y extensión de 1 min 30 s a 72°C, seguido de una extensión final de 10 min a 72°C. Los productos fueron separados por electroforesis en 0.9% de gel de Agarosa sumergido en buffer Tris-acetate-EDTA (TAE) a una concentración de 1X a 120 voltios por 70 minutos.

Evaluación de las muestras mediante la PCRm.
Se realizó la reacción de PCRm para cada ADN extraído empleando como control positivo las muestras previamente identificadas, y como control negativo agua ultrapura. Las 20 muestras fueron secuenciadas en base al gen del hexón en el Poultry Diagnostic and Research Center (PDRC) de la Universidad de Georgia en EEUU, para determinar la sensibilidad de la PCRm optimizada frente a la prueba de referencia (gold estandard).

Resultados

Diseño de cebadores específicos.
Se obtuvo un porcentaje de identidad entre 90- 100% de cada cebador frente a serotipos de su misma especie, y sin interferencia con otras especies de virus aviares. Se obtuvieron las secuencias de nucleótidos de los cebadores (datos por publicar) con un tamaño esperado de 1186 bp, 978 bp y 1655 bp para FAdV4, FAdV-8b y FAdV-11, respectivamente.

Optimización de la PCRm.
En la Figura 1, se visualizaron simultáneamente los productos definidos e intensos del tamaño esperado para cada serotipo. Es el primer estudio de caracterización molecular de
FAdV-I (FAdV-4, 8b y 11) mediante una PCR múltiple.

Esta alternativa diagnóstica permitió reducir el tiempo de trabajo y de entrega de resultados, así como aminorar costos de laboratorio.

Evaluación de las muestras mediante la PCRm.
Se caracterizaron los serotipos 4, 8b y 11; de los cuales 11 muestras (55%) fueron positivas a FAdV-4, 6 (30%) a FAdV- 8b y 2 (10%) a FAdV-11. Asimismo, se observó la presencia de una coinfección entre FAdV-4 y FAdV-11 (5%) (Figura 2).

La muestra de coinfección entre FAdV- 4 y 11 fue tomada como positiva para ambos serotipos al comparar los resultados de la PCR múltiple frente al secuenciamiento por el gen del hexón.

Se determinó un 100% de sensibilidad de la PCRm frente a la prueba de referencia (Cuadro 1).

Conclusiones
Es el primer estudio de caracterización molecular de FAdV-I (FAdV-4, 8b y 11) mediante una PCR múltiple. Esta alternativa diagnóstica permitió reducir el tiempo de trabajo y de entrega de resultados, así como aminorar costos de laboratorio. Asimismo, la PCRm se puede emplear como herramienta de vigilancia epidemiológica para facilitar la implementación de programas específicos de vacunación, o como control de calidad en la identificación de inóculos virales en plantas de producción de vacuna.

Para mayor información o solicitar la bibliografía del presente estudio escribir a: melanie.caballero@quimtia.com