Identificación del aislado de una cepa del virus de influenza aviar (AIV) H5N1 – CLADO 2.3.4.4B en pelícanos (Perú)

Autores: Manolo Fernández, Doris Villanueva, Luis Tataje, Angela Montalván, Gisela Isasi,
Milagros Lulo, Manolo Fernández S.
Chincha – PERU, 13/01/2023

En los últimos años, la influenza aviar tipo A ha sido responsable de graves brotes en aves migratorias y comerciales en todo el mundo, lo que ha llevado a una creciente preocupación para su control y prevención. Los virus de la influenza A se dividen en subtipos de acuerdo con dos proteínas de la superficie del virus: la hemaglutina (HA) y la neuraminidasa (NA). Se conocen 18 subtipos HA y 11 subtipos NA. En aves, se identificaron 16 subtipos HA y 9 subtipos NA. Se detectaron otros dos subtipos, H17N10 y H18N11, en murciélagos. Muchas combinaciones diferentes son posibles de las proteínas HA y NA identificándose más de 130 subtipos de influenza A en aves silvestres, posiblemente hay muchas más combinaciones de subtipos dada a la «redistribución» del virus. La redistribución se produce cuando dos o más virus de influenza infectan a un organismo hospedador al mismo tiempo (coinfección) e intercambian información genética. El AIV H5N1 clado 2.3.4.4b es uno de los más virulentos y ha sido responsable este año de brotes en la industria avícola de EE. UU., México y países de Europa y Asia. Razón por la cual es importante y necesario utilizar tecnologías moleculares de última generación que permitan aislar, identificar y tipificar de manera rápida y segura la existencia de variantes y de esta forma establecer medidas de control y prevención eficientes.

En diciembre del 2022, en las playas del distrito de Tambo de Mora, provincia de Chincha, departamento de Ica, Perú se recolectaron muestras mediante hisopado traqueal de pelicanos muertos sospechosos de tener AIV. Las muestras fueron enviadas a nuestro laboratorio de bioseguridad III (BSL-3) para su identificación mediante PCR en tiempo real utilizando un juego de primer dirigido al gen matriz (M) (Spackman, 2014) y descarte de otros patógenos. Las muestras de hisopado positivas a AIV fueron inoculadas en embriones SPF de 10 días de edad para su aislamiento, luego a las 72 horas de incubación se recolectaron los líquidos alantoideos y se sometieron a pruebas de PCR en tiempo real y de punto final utilizando varios juegos de primers dirigidos al gen M (Spackman, 2014), HA (Liu et al., 2018) y NA (Huang, Khan, & Măndoiu, 2013) para su confirmación y tipificación.

Sólo el aislado codificado como VFAR-140 fue concentrado y purificado, para secuenciar su genoma mediante tecnología de última generación, de la compañía Oxford Nanopore. Se utilizó el kit Direct cDNA Sequencing Kit (SQKDCS109) con la plataforma MinION Mk1B. Las lecturas obtenidas se analizaron con diversos programas bioinformáticos. Los procedimientos incluyeron recorte de adaptadores con el programa Porechop, ensamblaje de novo con el programa RAVEN, mapeo con secuencias referenciales con el programa BWA-MEM y Samtools, e identificación con BLASTn.
Como resultado de las ocho muestras de hisopado, seis resultaron positivos al PCR en tiempo real, y punto final para AIV H5N1 (Fig. 1 y 2).

Fig. 1. Identificación de AIV a partir de hisopados mediante PCR en tiempo real
dirigido al gen M
Fig. 2. Tipificación de AIV mediante PCR de punto final dirigido a los genes HA y NA.

A partir del secuenciamiento del aislado VFAR-140 se obtuvo un total de 369.09 MB equivalente a 10.14 k lecturas en pocas horas de secuenciación. Mediante el análisis bioinformático se recuperó el segmento 4, que contiene al gen HA con 1750 pb (64.05X de profundidad promedio), con una identidad del 99.09% con la secuencia A/snow goose/Kansas/W22-199E/2022(H5N1) (OP221374.1). Asimismo, se recuperó el segmento 6, que contiene al gen NA con 1414 pb (152.17X de profundidad promedio), con una identidad del 98.85% con la secuencia A/goose/CzechRepublic/18520-1/2021(H5N1) (OL636394.1). Tanto la secuencia OP221374.1 como la OL636394.1 han sido reportados previamente como aislados H5N1 pertenecientes al clado 2.3.4.4b (Mosaad et al., 2023).

Fig. 3. Alineamiento de la secuencia HA (segmento 4) de VFAR-140 con secuencias
similares.
Fig. 3.1. Representación gráfica del alineamiento de la secuencia HA (segmento 4) de VFAR140 con secuencias similares. En amarillo se aprecia la ubicación de la secuencia VFAR-140.

En conclusión, nuestros resultados muestran el primer hallazgo de AIV H5N1 clado 2.3.4.4b en aves pelicanos de la costa peruana, pertenecientes a la familia monotípica pelicanidae, lo que representa un riesgo potencial para la industria avícola del país y la salud humana. Por tal motivo, creemos que es necesario e importante continuar monitoreando la presencia del virus y tomar medidas de control y prevención apropiadas a fin de evitar brotes masivos que conlleven a grandes pérdidas económicas principalmente en la industria avícola peruana.

REFERENCIAS
Huang, Y., Khan, M., & Măndoiu, I. I. (2013). Neuraminidase Subtyping of Avian
Influenza Viruses with PrimerHunter-Designed Primers and Quadruplicate Primer
Pools. PLoS ONE,
8(11), e81842. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081842
Liu, J., Yao, L., Zhai, F., Chen, Y., Lei, J., Bi, Z., … Zhou, J. (2018). Development and
application of a triplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of avian
influenza virus subtype H5, H7 and H9. Journal of Virological Methods, 252, 49–56.
https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.11.005
Mosaad, Z., Elhusseiny, M. H., Zanaty, A., Fathy, M. M., Hagag, N. M., Mady, W. H., …
Naguib, M. M. (2023). Emergence of Highly Pathogenic Avian Influenza A Virus
(H5N1) of Clade 2.3.4.4b in Egypt, 2021–2022. Pathogens, 12(1), 90.
https://doi.org/10.3390/pathogens12010090
Spackman, E. (2014). Avian Influenza Virus Detection and Quantitation by Real-Time
RT-PCR. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0758-8_10

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